【摘要】 
       目的探讨三七总皂苷（PNS）对快速老化小鼠SAMP8空间学习记忆功能的改善作用。方法采用Morris 水迷宫方法以寻求次数、逃避潜伏期、原平台象限比、跨平台次数等为指标观察其行为学改变。结果PNS高、低剂量组在Morris 水迷宫测试中，逃避潜伏期明显低于空白组；寻求次数、原平台象限比、跨平台次数明显增加，与空白组比较有显著性差异（P<0.05）。结论PNS对SAMP8学习记忆功能有明显改善作用。
       【关键词】  三七总皂苷； 快速老化小鼠SAMP8； 学习记忆； Morris 水迷宫
       Influence of PNS on Abilities of Space Search, Learning and Memory in SAMP8 with Alzheimer"s Disease
        WU Dengpan, ZHONG Zhenguo*, WANG Jinsheng, WANG Naiping, ZHANG Wenyan, L Liang, QU Zeqiang
        Center of Research & Development of New Drugs, Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning  530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
        Abstract：ObjectiveTo investigate the relieving effect of panax notoginesenoside (PNS) on the disorder of the abilities of space search, learning and memory in SAMP8 with Alzheimer"s disease. MethodsThe test of Morris water maze (MWM) was used to examine the changes of the abilities of space search.ResultsAll indexes of Morris water maze demonstrated that learning and memory in different groups with PNS and huperzine A were remarkably improved compared with that of the control group (P<0.05). ConclusionPNS has a significant relieving effect on the lesion of the abilities of space search, learning and memory in SAMP8.
        Key words：Panax notoginesenoside; SAMP8;   Learning and memory;   Morris water maze
        老年性痴呆又称阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease, AD），是一种多发的常见疾病，发病率随着年龄的增长而增高。流行病学调查显示，我国60岁以上人群有10%患痴呆，80岁以上者达20%～30%，随着世界人口逐年老龄化，其发病率也在不断上升，但目前仍缺乏有效的防治药物和方法。中药三七为五加科多年生草本植物三七Panax notoginseng (Burk) F.H. Chen 的根。传统中医理论认为其性味甘、微苦、温，归肝胃经，具有化瘀、止血、活血定通之效。现代药理研究表明，三七对心血管系统、血液系统、免疫系统、神经系统等均有不同程度的药理作用，而对神经系统损害的保护作用尤为引人注目［1］。此前的研究已表明，三七总皂苷(total saponins of panax notoginseng, PNS)对以d-半乳糖腹腔注射致亚急性损伤合并鹅膏蕈氨酸(Ibotenic acid，IBA)损毁双侧大脑Meynert基底核建立的AD大鼠动物模型的空间学习记忆损害具有明显改善作用［2］。然而，PNS对较接近于老年性痴呆发病机制的快速老化小鼠SAMP8的空间学习记忆能力是否具有同样的保护作用仍是不清楚的。为此，我们应用Morris 水迷宫（Morris water maze, MWM）评价了PNS对快速老化小鼠SAMP8的空间学习记忆能力的保护作用，以进一步探讨PNS对AD的空间学习记忆能力的影响。
       1  材料与仪器
        1.1  药品和试剂PNS，云南玉溪维和制药厂生产, 批号20050701；石杉碱甲（huperzin A，Hup-A），浙江震元制药有限公司生产，批号040801。
        1.2  仪器Morris水迷宫设备全套，北京中科院生理所生产（包括Morris水迷宫、电脑摄像系统、配套软件分析系统）。
        1.3  动物快速老化小鼠SAMP8（以下简称小鼠）70只，体重20～30 g，天津中医药大学提供（合格证号：W－J津实动质M准字第006号）。
        2  方法
        2.1  动物分组及给药将实验小鼠随机分为空白对照组（简称空白组）、PNS高剂量组（简称高剂量组）、PNS低剂量组（简称低剂量组）、石杉碱甲组（阳性对照组，简称阳性组），每组30只，另留10只（模型对照组，简称模型组）在给药前进行检测记忆、行为，以与用药后进行对照分析用，同时也用于检验模型是否成功。
        动物适应性喂养2周后给药。PNS和石杉碱甲以双蒸馏水调配后灌胃给药。PNS高剂量按93.5 mg/kg给药，PNS低剂量按23.38 mg/kg给药（参照临床成人用量：每天360 mg/70 kg）；阳性对照药石杉碱甲按0.0386 mg/kg给药（参照临床成人用量：每天0.3 mg/70 kg）；空白对照组给予给药组相同容积的双蒸馏水灌胃。灌胃1次/d，连续给药2个月。
        2.2  小鼠学习与记忆行为测试采用MWM测试法，进行定位航行实验和空间探索实验。MWM参照有关文献制作［3］。迷宫置于房间中间，为一圆形不锈钢水池，直径200 cm，高50 cm，水深30 cm，水温保持在(26±1)℃。将水池等分为4个象限，在象限3中心放置一平台，平台为圆形，直径为11 cm，平台高为29 cm（即平台低于水面1 cm，称隐藏平台），迷宫正上方2 m高处装有一个小型摄像机，并与另一房间的录像机和监视器连接，记录小鼠的游泳轨迹和游泳时间。
        2.2.1  定位航行实验（place navigation）共进行5 d。MWM实验的第2天～6天，进行定位航行试验。平台位于第3象限，没于水下1 cm，小鼠入水点为各象限池壁中点，每天分上下午两个时间段，每一个时间段每鼠训练4次，将小鼠面向池壁由4个入水点放入次池中，测其60 s内成功进驻平台（小鼠找到平台并滞留其上5 s为成功进驻）所需时间（即逃避潜伏期，escape latency）。如在60 s内小鼠不能成功进驻平台，则实验者将其引上平台并令其停留10 s，记录逃避潜伏期为60s。
        2.2.2  空间探索实验（spacial probe test）MWM实验第7天，进行空间探索实验：撤除平台，从WN象限（原平台象限对侧）池壁中点将小鼠放入水中，记录2 min内小鼠在原平台象限的游泳时间和游泳轨迹，计算小鼠跨越平台次数以及各象限游泳时间占总时间百分比。
        2.3  评价指标与统计学方法定向航行实验统计量为逃避潜伏期、寻求次数，空间探索试验统计小鼠原平台象限游泳时间占总游泳时间百分比、跨越原平台次数。结果以SPSS 11.5 for Windows 统计软件分析，各组间差异采用重复测量多因素方差分析以及单因素方差分析，同时进行Levene方差齐性检验，方差齐性资料各组采用F检验，各组间采用LSD（least-signficant difference，最小显著差值法）法或SNK（Student-Newman-Keuls）法两两比较；方差不齐资料采用近似F检验Welch或Brown-Forsythe法，各组间采用Dunnett"s T3或Dunnett"s C法两两比较［4～6］。方差齐性检验水平取α=0.05，方差检验显著性水平取α＝0.05。
        3  结果
        3.1  定位航行实验 各组平均逃避潜伏期5 d前后变化的结果见图1。
        观察时间
        图1  各组平均逃避潜伏期5d前后变化
        从结果可以看出，经过5 d的训练，空白组的逃避潜伏期曲线平稳，5 d的变化不大，给药治疗的各组潜伏期随着训练天数的增加而明显缩短，说明模型组大鼠学习记忆行为能力明显受损,药物对痴呆模型均有一定程度的保护作用，Levene方差齐性检验显示潜伏期、寻求次数、停留时间及平台象限百分比方差均不齐，故采用Welch法分别对各指标作方差分析，结果潜伏期F=33.043，P=0.000；寻求次数F＝27.241，P=0.000；停留时间F=15.533，P=0.000；平台象限百分比F=315.39，P=0.000。说明各组MWM行为学指标5 d综合变化均有非常显著性差异（P<0.01）。以Dunnett"s T3法进一步对各组作两两比较结果详见表1。表1  各组MWM行为学相关参数5 d均值总体比较由表1可见空白组的逃避潜伏期明显延长，与其他各相比均有非常显著性差异（P<0.01），高剂量组与其他各组比较均有非常显著性差异（P<0.01）。空白组的寻求次数与其他各给药组比较都有非常显著性的差异（P<0.01），高剂量组与其他各组的比较也具有非常显著性差异（P<0.01）。
        3.2  空间探索实验 结果见表2。
        表2  各组大鼠原平台象限比与跨平台次数比较由表2可见，模型组与空白组相比有非常显著性的差异（P<0.01），但与其他各组比较差异并不显著（P>0.05），空白组与其他四组比较差异非常显著（P<0.01），高剂量组分别与低剂量组相比有非常显著性差异（P<0.01），与阳性组相比差异亦很显著（P<0.05），但与模型组比较差异无显著性（P>0.05）。
       4  讨论
        AD患者的临床表现为智力减退,近期记忆缺失,以及相关行为能力障碍,因此观察模型及药物治疗效果的重要指标之一,就是对学习记忆进行直接客观的评价。MWM实验是英国心理学家于20世纪80年代初设计并用于空间学习记忆的大脑机制研究领域［7］。就记忆属性的不同分类系统来看，经典所检测的是大鼠在多次的训练中形成的一种空间参考记忆，其储存的机制主要涉及边缘系统及大脑皮层有关脑区,属于陈述性记忆［8］，临床健忘或痴呆的患者，正是陈述性记忆首先受损而且比较突出［6］，所以从检测的记忆属性来说,运用系统进行防治此类疾病有效药物的筛选研究是较为恰当的，试验作为记忆量化的良好方法,其提供的参数众多,定位航行试验历时5 d，实验数据结构庞大且复杂,为准确反映出各组数据间客观存在的内在联系,统计学处理采用胡镜清等［2］推荐的重复测量多因素方差模型进行分析处理。
        快速老化痴呆性小白鼠SAMP8是由日本京都大学竹田俊男教授经20年近代延交培育而成，具备均一的遗传背景和稳定老化病态特征，其快速老化自然产生，与临床痴呆的渐进性发生极为相似，尤其能在大脑形成β-Ap沉积，并随着年龄增加而表达量增加，是目前研究老年性痴呆的较理想的模型［9～11］。在定位航行实验和空间探索实验中，空白组小鼠的各指标均劣于其他各组，差异显著；定位航行实验中各天的学习成绩变化缓和，改善程度很不明显，表明造模使小鼠智能发生严重障碍，学习记忆获得能力及记忆的存储、加工和提取能力均严重受损。这说明我们采用的快速老化痴呆型小白鼠SAMP8的动物模型是成功的。
        定位航行实验的5 d训练中，PNS高低剂量组和阳性组组内训练成绩各天总体变化较空白组明显。PNS高剂量组总体表现相比空白组在训练第1天开始就显示出优势，而且随着训练时间的延长，优势越来越明显；而PNS低剂量组和阳性组则在后2，3 d才显示出优势。说明治疗药物对空白组小鼠的学习记忆能力缺陷和相关行为障碍均具有不同程度的改善作用。其中PNS高剂量组总体表现明显优于其他给药各组，表现在小鼠对逃避潜伏期的缩短，较阳性组及低剂量组差异显著；在寻求次数方面，高剂量组都优于低剂量组和阳性组。第7天的空间探索实验各指标中，原平台象限百分比PNS高、低剂量组都比空白组高，差异显著，而各给药组和模型组之间两两比较差异并不显著。对跨越平台次数指标分析表明，空白组、高剂量组分别与其他4组比较有显著性差异，说明药物的治疗对空白组痴呆小鼠的学习记忆能力起到了改善作用，结合前面的定位航行实验指标，可认为药物对快速老化痴呆小鼠模型的保护作用使其学习记忆能力已经达到并超过了给药前水平。
        通过对影响模型大鼠空间学习记忆的研究发现，对快速老化痴呆模型小鼠学习记忆功损害有明显的改善作用，为三七的临床新用途提供了参考。
       【参考文献】
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