摘要：目的：观察电针预处理对慢性心肌缺血大鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的影响，探讨电针预处理防治慢性心肌缺血的作用机制。方法：采用SPF级雄性wistar大鼠45只，随机分为3组：正常组、模型组、电针预处理组，每组15只。除正常组连续14天皮下注射0.9%NaCl外(2mg/kd/d)，其他两组均每日给予异丙肾上腺素（Isoprenaline，ISO）（2mg/kg/d）皮下注射，每日一次，连续14天。电针预处理组在当天造模前即给予针刺“内关”、“关元”、“足三里”，该组同侧穴位组成一对，即同侧“内关”穴连接同侧“足三里”穴，连接HAN-200型电针仪，频率2Hz，电压1.6V，强度1mA，以大鼠肢体有震颤感为适宜强度，每次10min，正常组和模型组相同时间抓取固定，每日一次，共21天。应用Agilent Sonos 5500型彩色超声心动图诊断仪检测计算左室舒张末内径（LVEDD）、左室收缩末内径（LVESD）以及左室射血分数（LVEF），以 LVEF≤45%为造模成功；记录治疗后各组大鼠的心电图及ST段电压变化；采用Elisa检测各组大鼠血清中的VEGF含量; Western blotting检测心肌梗死区VEGF表达。结果：模型组大鼠的左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)均高于正常组（P＜0.01），左室射血分数（EF）低于正常组大鼠（P＜0.01）；电针预处理组LVEDD值低于模型组（P＜0.01），LVESD值低于模型组（P＜0.01），EF值高于模型组（P＜0.01）；造模后，模型组大鼠ST段电压明显高于正常组，血清中VEGF含量高于正常组（P<0.01）；造模及治疗后，电针预处理组大鼠的ST段电压低于模型组，电针预处理组VEGF含量高于模型组（P<0.01）。模型组心肌组织梗死区VEGF蛋白表达低于正常组（P<0.01），电针预处理组心肌组织梗死区VEGF蛋白表达高于模型组（P<0.01）。结论：电针“内关”、“足三里”、“关元”预处理，可促进慢性心肌缺血大鼠VEGF表达，促进血管再生，改善心功能、缩小缺血心肌面积，有效防治慢性心肌缺血。

关键词：电针预处理；心肌缺血；VEGF   

 

 

目前研究证明，血管新生（Angiogenesis，AG）可促使缺血周边组织侧支循环的建立[1、2]，心肌缺血后，缺血区血管新生和侧枝循环的水平能直接影响心脏梗死的面积、心室重构的程度及心功能的改善情况[3]。AG在已有血管的基础上，通过血管内皮细胞的增殖、游走、芽生和血管分裂而形成新的微血管网，从而恢复血运，有效防止缺血心肌坏死和凋亡[4]。研究证实[5、6]，针刺可以通过多种途径来实现心肌保护，比如减少自由基的产生，调控凋亡基因的表达水平等，那么针刺是否能通过促进血管再生从而达到保护心肌细胞，缓解组织缺血、缺氧的作用，值得我们进一步研究与探讨。笔者以慢性心肌缺血大鼠为模型，从血管再生这一角度，观察电针预处理对慢性心肌缺血大鼠血管内皮生长因子的影响，探讨针刺防治心肌缺血的作用机制。

1.材料与方法

1.1实验动物与分组 

       采用3月龄SPF级雄性Wistar大鼠45只（湖北省动物实验研究中心购买，动物许可证号：SCXK(鄂)2008-0005，实验动物质量合格证号：42000600006844），体重250-300g。随机分为3组：正常组、模型组、电针预处理组，各15只，大鼠适应性喂养1周后开始实验。实验过程严格遵循2006年国家科技部发布的《关于善待动物的指导性意见》。

1.2造模

      参照Yin等[7]造模方法，模型组及治疗组均采取腹部皮下注射盐酸异丙肾上腺素2mg/kg，连续14天。14天后用M型彩色超声监测仪测量左室射血分数(LVEF)，以 LVEF≤45%作为造模成功。

1.3干预方法

      造模开始当天即行干预治疗。正常组连续14天腹部皮下注射生理盐水，模型组、电针预处理组行心肌缺血造模，模型组不进行针刺干预，与电针预处理组相同时间抓取固定；电针预处理组采取针刺干预治疗，针刺取穴参照《实验针灸学》的常用实验动物针灸穴位定位方法取穴[8]，选用28号0.5寸（0.38mm×13mm）不锈钢针（华佗牌GB2024-94,苏州医疗用品厂生产）直刺0.2-0.4寸。电针预处理组于造模前给予“内关”（PC6）、“足三里”（ST36）及“关元”（CV14）穴电针治疗，该组同侧穴位组成一对，即同侧“内关”穴连接同侧“足三里”穴，连接HAN-200型电针仪，频率2Hz，电压1.6V，强度1mA，以大鼠肢体有震颤感为适宜强度。每次10min，每日一次，共21天。

1.4取材及标本处理

       各组动物根据实验要求在实验结束后的第二天（第22天），10%水合氯醛溶液按0.35ML/100g剂量麻醉后，腹主动脉取血收集动物血样，开胸取心脏组织样本，每组15个标本，4%多聚甲醛（双蒸水配制）4℃固定24小时,以用于心肌组织病理学结构观察。用剪刀剪取约50mg组织，置于组织匀浆器中，匀浆、离心，置于-80℃冰箱保存用于免疫印迹检测蛋白。 

1.5仪器及主要试剂

      盐酸异丙肾上腺素（ISO）：上海禾丰制药有限公司生产（规格 2ml：1mg，上海禾丰制药有限公司，批号：S1105）；包埋石腊（国药集团，NO:10011018）；中性树胶（国药集团，NO：10004160）；HAN-200型电针仪（南京济生医疗科技有限公司）；迷你电泳槽（北京六一Cat#DYZC-24DN）；病理切片机（德国Leica RM 2016轮转式切片机）；切片刀（日本羽毛R35一次性刀片）；组织摊烤片机（武汉俊杰JK-6生物组织摊烤片机）；显微镜（OLYMPUS BX53型生物显微镜）；Agilent Sonos 5500 型彩色二维超声心动图诊断仪（美国Philips公司）；-80℃低温冰箱（日本SANYO公司）。

1.6指标检测

1.6.1超声心电图

       大鼠在第22天，经10%水合氯醛腹腔注射麻醉，以备皮刀心前区剃毛，仰卧固定于鼠板上，应用Agilent Sonos 5500型彩色超声心动图诊断仪，10S探头，频率为8MHz，对大鼠的心脏大小及功能进行检测。检测指标包括：左室舒张末内径（LVEDD）、左室收缩末内径（LVESD），并通过计算机计算出左室射血分数（LVEF）。

1.6.2心电图

        记录造模前各组正常时心电图，治疗结束后第2天，即第22天再次使用BL-420生物机能系统检测各组大鼠的心电图。大鼠用10%水合氯醛麻醉后， 仰卧位固定于恒温控制操作台上 用针状电极刺入大鼠肢体皮下，按人体标准导联（Ⅱ） 连接方法：将正极接在左下肢，负极接在右上肢通过 BL420生物机能测试系统记录心电图，观察ST段电压的变化。

1.6.3酶联免疫吸附试验（Elisa）检测血管内皮生长因子（VEGF）

       于第22天取材时，麻醉开胸暴露心脏，采用心脏部位取血法收集大鼠血液于抗凝管中，置于4℃冰箱保存24h，将血液样品1000r／min，离心15min后吸取上清，待测。

1.6.4蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测血管内皮生长因子（VEGF）

       用剪刀剪取约50mg组织，置于组织匀浆器中，匀浆、离心，洗膜后加入二抗，室温振荡孵育，充分洗膜并进行显色。VEGF蛋白的含量水平用VEGF蛋白灰度值来表示(该蛋白条带的灰度值=背景的灰度值)/(内参条带的灰度值=背景的灰度值)，以此比值计算均数与标准差。

1.7数据分析

       数据采用SPSS20.0处理分析，计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著性统计学意义。

2.结果

2.1各组大鼠的心脏功能的比较（见表1、图1）

       模型组大鼠的左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)均高于正常组（P＜0.01），左室射血分数（EF）低于正常组大鼠（P＜0.01）且EF≤45%，提示造模成功。电针组LVEDD值均低于模型组（P＜0.01），LVESD值低于模型组（P＜0.01），EF值高于模型组，具有非常显著性差异（P＜0.01）。

 

2.2各组大鼠治疗后的ST段电压比较

        造模及治疗前，正常组、模型组及针刺组比较ST段电压无统计学差异；造模后，模型组大鼠ST段电压明显高于正常组（P<0.01），且明显高于造模前模型组（P<0.01）；造模及治疗后，电针预处理组大鼠的ST段电压低于模型组，具有非常显著性差异（P<0.01）。

 

注：与正常组比较，#P<0.01;与模型组比较，*P<0.01。 

2.3各组大鼠血清中VEGF含量比较（见表2）

       模型组血清中VEGF含量高于正常组，具有非常显著性差异（P<0.01）;与模型组比较，电针预处理组血清中VEGF含量上升，具有非常统计学差异（P<0.01）。

2.4各组大鼠心肌梗死区VEGF蛋白表达

        图4、5可见，心肌梗死区模型组大鼠VEGF蛋白的表达明显低于正常组（P<0.01），电针预处理组心肌梗死区VEGF蛋白表达高于模型组（P<0.01）。

 

3讨论

       新生血管属中医之“血络”范畴，《灵枢·血络论》云：“血络者，外之络脉、孙脉，见于皮肤之间，血气有所留积，则失其外内出入之机。”《内经》中“血络”一般指细小的血管，或是经络系统中的络脉、孙络。《灵枢·热病》云：“心病暴痛，取足太阴、厥阴，尽刺去其血络。”因此，就中医而言，心气的盛衰与血络的功能活动息息相关，心脏发生病变，常影响血络的功能，反之，血脉之病变，也应从心而治[9]。“心肌缺血”属中医学的血络损伤气血不足、血运不通、不荣之证。一般认为“心肌缺血”的病机属“本虚标实”，“本虚”虚者多为气、血、阴、阳亏虚，尤以气虚及阳虚多见；“标实”者多为气滞、血瘀、痰浊等，又以血瘀及痰浊多见。临床上，针灸治疗心肌缺血一般应用循经取穴法、辨证取穴法、分部取穴法等选穴方法，但因个体差异性和针刺手法及技术的差异性，临床效果也有差异。本实验在中医“治未病”思想的指导下，应用“标本配穴”法[10]选取“内关”用于祛除病邪，“内关”所属心包经，为手厥阴心包经络穴，通于任脉，会于阴维，是八脉交会穴之一，一直为古今针灸防治心绞痛、心肌炎等心胸疾病的经典穴和首选穴；再选取“关元”、“足三里”两穴位用以固护先天、后天之气，达到标本兼治，通补兼施[11]。因此，笔者以选取针刺“关元”、“足三里”、“内关”穴作为电针预处理组，用以防治慢性心肌缺血，探讨电针预处理防治心肌缺血疾病的疗效。

       VEGF是一种肝素结合蛋白，组织缺血缺氧可反馈性的刺激VEGF表达增加[12]，并且可促进内皮细胞有丝分裂和新生血管的形成，作为AG正性调控因子中己知作用最强、特异性最高血管生成因子，可通过增加血管通透性，抑制细胞凋亡，促进内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)增殖、迁移，从而促使新生血管的形成，缓解心肌缺血缺氧[13]。当发生心肌缺血时，心肌缺血大鼠心肌组织和血清受到刺激促进VEGF表达，血管新生形成并开放冠脉侧支循环[14]，能减轻损伤心肌的缺血缺氧、防止心肌细胞坏死、预防和延缓的形成，缺血区血管再生和侧支循环的水平影响心脏梗死的面积，同时也影响心室重构的程度及心功能的改善情况。已有实验证明[15]，内关穴位埋针可通过上调VEGF基因及蛋白表达，增加毛细血管密度，促进侧支循环建立，增加缺血心肌血流，使缺血心肌损伤修复。

      本实验发现，心肌缺血后，心功能出现异常，ST段电压上升，反馈性刺激多种细胞分泌VEGF导致血清中VEGF表达上升，促进血管生成因子合成和血管内皮修复，缓解组织缺血缺氧，心肌梗死区VEGF表达下降。电针预处理干预后，电针预处理组较模型组ST段电压下降，血清中和心肌梗死区的VEGF表达增加，较模型组明显改善，说明电针预处理可明显改善心脏功能，刺激心肌梗死区和血清中VEGF表达增加，促进血管再生，缩小缺血心肌面积，降低缺血对心肌的损伤，保护心肌组织。

      目前，“穴位针刺预处理”已广泛应用于防治各类疾病，例如心、脑、胃肠等预防和抗缺血缺氧时采用。“穴位针刺预处理”这种理念的运用正是针灸“治未病”思想在现代医学模式下的产物，与现代医学预防疾病思想有异曲同工之妙[16]。本实验在此理念的指导下，采取14天的电针预处理和7天的造模后穴位电针治疗相结合的实验方法，并依据“标本配穴”法进行选穴，目的在于通过鼓舞机体正气，加强机体的抗病能力，从而预防心肌缺血的发生和（或）减轻心肌缺血对机体的损害，恰与中医“治未病”中的“未病先防，既病防变”吻合。实验证实，针灸“治未病”对于防治慢性心肌缺血具有一定功效，这为以后的临床运用提供了实验依据。

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