摘要

    电针治疗脑缺血后认知功能障碍已被广泛应用，但其机制尚未完全阐明。研究表明，自噬在认知功能障碍的形成和发展中起着重要作用，而磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信号通路在自噬调节中起着重要作用。为探讨PI3K/Akt信号通路在电针治疗大鼠脑缺血再灌注模型中的作用，首先采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。造模后2h开始电针神庭、百会穴，扩张波(频率1~20 Hz，强度2 mA，峰值电压6V)，30min/d，连续8d。结果表明，电针可缩小脑缺血再灌注损伤大鼠的脑梗死体积，提高缺血大脑皮层PI3K/Akt信号通路相关因子Beclin-1、哺乳动物雷帕霉素靶标(MTOR)和PI3K的mRNA表达水平，提高磷酸化Akt、Beclin-1、PI3K和mTOR的蛋白表达水平，同时降低P53mRNA和蛋白表达水平。在Morris水迷宫实验中，接受电针刺激的大鼠与未接受电针刺激的大鼠相比，找到隐藏平台的潜伏期明显缩短。在空间探测实验中，与未接受电针刺激的大鼠相比，接受电针刺激的大鼠跨越目标象限的次数增加。电针刺激神庭穴和百会穴激活了PI3K/Akt信号通路，改善了大鼠的学习记忆障碍。

主要内容

    脑卒中患者急性期和慢性期认知功能减退，尤其是学习记忆功能减退，临床发病率很高。临床研究表明，25%-30%的中风后损伤幸存者患有即刻或延迟性认知障碍，这显著影响了提高体能所需的康复计划。电针具有双重疗效，代表了一种简单、方便和成本效益高的治疗方案，已被广泛用于治疗脑缺血后的认知障碍。许多研究表明，自噬在认知障碍的形成和发展中起着重要作用，抑制细胞凋亡可以减轻缺血再灌注损伤。许多激活的信号通路调节卒中后的自噬和凋亡，如磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)和核因子-κB信号通路，它们在细胞凋亡的调节中起关键作用。因此，推测PI3K/Akt信号通路在神经细胞自噬调节网络中的调节可能代表了电针改善卒中后认知损害的机制。本研究旨在探讨电针百会穴和神庭穴是否通过PI3K/Akt信号通路改善大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠的学习记忆障碍。

结果

1. 电针对局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠神经功能缺损和梗死体积的影响

    本研究采用神经学评分的方法评价电针GV20、GV24穴位是否能改善MCAO后的神经功能。神经学评分下降表明神经功能得到改善。假手术组的大鼠没有表现出任何神经缺陷的迹象。MCAO后4~8d，MCAO+电针组神经功能评分明显低于MCAO组(P<0.05；表2)。2，3，5-三苯基四氮唑氯化铵染色法测定脑梗死体积。MCAO组和MCAO+电针组脑梗死体积明显大于假手术组(P<0.05)，表明MCAO模型建立成功。术后8d，MCAO+电针组脑梗死体积明显缩小(与MCAO组比较，P<0.05)，说明电针对局灶性脑损伤有明显的预防作用(图1)。

2. 电针治疗对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠缺血周皮质细胞凋亡的抑制作用

    在电子显微镜下，假手术组可见丰富的线粒体，完整的线粒体嵴、整齐的溶酶体和完整的细胞核仁。可见较大的轴突，染色质分布均匀。MCAO组缺血周围皮质线粒体肿胀，线粒体嵴破坏，溶酶体排列紊乱，细胞结构紊乱，常染色质出现在神经元核边缘。MCAO组细胞体积较小，电子密度较深。所有这些观察结果都与早期凋亡信号一致。MCAO+电针组细胞膜部分破裂，线粒体轻度受损。MCAO+电针组大鼠粗面内质网和染色质未见明显改变。核仁完整，染色质分布均匀(图2)。

3.电针对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠局灶性脑缺血周围皮质PI3K/Akt信号通路相关基因和蛋白表达的影响

    PCR结果显示，与假手术组相比，MCAO+电针组PI3K、p53、mTOR、Beclin-1mRNA表达水平明显升高(P<0.01)，而PI3K、mTOR、Beclin-1mRNA表达水平显著高于MCAO组(P<0.05)。而MCAO+电针组P53 mRNA表达明显低于MCAO组(P<0.01)。MCAO组和MCAO+EA组Akt mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05；图3)。Western blot结果显示，与MCAO组相比，MCAO+EA组缺血周围皮质p-Akt、Beclin-1、PI3K和mTOR表达水平显著升高(P<0.05)，而p53表达水平显著降低(P<0.05)，Akt蛋白表达无明显变化(P>0.05；图4)，与MCAO组相比，MCAO+EA组缺血周围皮质p-Akt、Beclin-1、PI3K和mTOR表达水平显著升高(P<0.05)，p53表达水平显著降低(P<0.05)。这些结果提示，电针可调节PI3K/Akt信号通路的激活。

结论

在本研究中，我们发现与MCAO组相比，MCAO+EA组PI3K、mTOR和Beclin-1的蛋白和mRNA表达水平显著升高，而p53蛋白和mRNA的表达水平则显著降低，而MCAO+EA组PI3K、mTOR和Beclin-1的蛋白和mRNA表达水平显著高于MCAO组。这些结果表明，脑缺血损伤后可诱导自噬，电针的应用加强了这一作用。因此，电针可能通过激活PI3K/Akt信号通路发挥神经保护作用。